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如何正確使用Quantiy One定量?

瀏覽次數:182發布日期:2021-08-05

                                                          如何正確使用Quantiy One定量?

                                                                圣賓儀器科技上海有限公司

WB做完,有時候我們需要對結果進行定量。目前最備受推崇的應該非Biorad公司的Quantiy One軟件莫屬,然而其$6K左右的售價令很多人望而卻步;不過,這款軟件之所以敢如此漫天要價,其最大的優點莫過于自動識別條帶代替人工分析以降低主觀誤差,同時它的很多功能滲透了艱深的數理理論以及概率統計的原理,這在其它各類免費的隨機附送的蛋白定量軟件上是乏善可陳的。不過,令人扼腕的是,又有多少人真的只是把它當做一款普通的“免費"軟件在使用著——暴殄天物。

目前多數免費軟件主要采用的是等高線定量法(Volumn Contour),Quantiy One也包含這部分內容且在網絡教程里面流傳最廣,以至于很多人只會這種并不準確的蛋白定量方法。等高線定量法通過半自動描繪電泳條帶的等高線邊緣來得到等高線區域內部面積,再將該面積乘以區域內平均光密度值得到條帶內部總的信號量。這種分析方法有明顯的弊病:人為圈定背景值且假定不同泳道的背景亮度一致;等高線的繪制處于“半自動"狀態,即需要人為判斷作為等高線標準的電泳條帶的邊緣;最致命的是在幾個電泳條帶距離十分接近的時候幾乎無法繪制單一條帶的輪廓(常出現連續的幾個條帶等高線相連而無法分離出單獨條帶的輪廓)。

     實際上,zuike學、嚴謹的蛋白定量方法應該是泳道/條帶軌跡定量法(Trace Tracking)。這種方法使用起來步驟較為繁瑣,必須通過泳道識別---電泳條帶識別這兩個連續的步驟才能進行定量。但它zuida優點在于可以完全拋棄人為主觀因素進行全自動定量。他的定量方式為:首先根據不同電泳條帶的光密度值繪制光密度曲線,然后計算光密度曲線下面積作為電泳條帶的定量根據。其次,它能夠最大chengdu的排除不同泳道之間的背景差異,讓各個泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎相同的起跑線上進行對比;這個背景排除功能是等高線法無法做到的。最終,采用泳道/條帶軌跡定量法分析條帶光密度后,再結合Gauss Model Bands對電泳條帶進行數理統計。


執行步驟:


由于Quantiy One只能識別黑白的TIF文件,而實際上發表論文時,很多雜志也要求提供TIF等格式的圖片而非JEPG格式的;因此,考慮到這兩層因素,我建議大家從一開始掃描就統一存貯為TIF格式的圖片。


1.創建泳道:


a.打開我們要分析的電泳圖片(以蛋白質電泳為例)。


b.選擇“Lane-Auto Frame lanes"。這時如果您的電泳圖片比較標準的話,Quantity One就會自動識別出每條電泳泳道的位置,而且將各個泳道的路徑用一條紅線標畫出來;

如果您對軟件自動標記的泳道不甚滿意,您可以通過“Lane-Edit Frame"下級各個子菜單提供的功能對泳道框架位置、大小等進行調節;調節方法就是通過鼠標的拖放來實現。


如果您只需要分析其中幾個泳道的數據而不想其他泳道的標記干擾您的視線,您可以通過“Lane-Single Lane-Remove Lane"刪除您不需要的泳道的標記。


注意:


不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被Quantity One自動識別。在不能自動識別的情況下,Quantity One就會彈出對話框告訴您它不能識別泳道。這時大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上面一樣,同過“Lane-Single Lane-Creat Lane"來實現。只要用鼠標在您的電泳圖片上順著待標記的泳道的中軸線拖放就可以繪制出該泳道的標記紅線。



2.不同泳道的背景排除:


我們要將我們的電泳圖片進行前面談到的泳道識別,不管是自動方式還是手工識別。然后選擇“Lane-Lane Backgroud..."命令。選擇該命令后,鼠標即變成一個綠色的“+",將鼠標移到您打


算進行背景排除的泳道,點擊左鍵一下,立刻就會彈出如下圖所示的對話框。


其中“Optical Density"顯示得是該泳道光密度值的分布情況。大家會注意到這個分布曲線并不是緊貼著縱軸,而是位于縱軸上方分布。造成這個“懸空現象"的原因就是該泳道自身存在著一定的光密度“背景"。這個背景的存在導致該泳道上各個電泳條帶之間不能處于同一水平進行對比;如果考慮到相鄰的其他泳道更是因為不同背景的存在而無法對比不同泳道上的不同電泳條帶。如何去除這個背景呢?我們繼續看右邊的“Lane Backgroud Substruction"對話框。這個對話框的上方“All Lanes"表示可以對所有泳道進行一次性處理;下方的“Selected Lane"表示僅針對此次選中的這個泳道進行處理。我們用鼠標選擇“Selected Lane"的“Lane On"選項。然后在下面的“Rolling Disk Size"里填上“5",再按“回車"鍵。大家再來看看現在“Optical Density"中出現了一條緊緊沿著光密度曲線分布的醬色曲線。這條曲線將泳道的背景與電泳條帶的光密度分布十分精確的劃分開來。


注意:


“Rolling Disk Size"是什么意思呢?實際上就是數理里面的微分等差逼近。我們可以將Quantity One提供的去除背景功能想象成是一個滾動的小球。如果這個小球的半徑越小,那么它沿著光密度曲線滾動時滾過的路徑就越發精細,具體反映在醬色曲線的軌跡越發靠近黑色光密度分布曲線的基線。因此從理論上來說“Rolling Disk Size"的取值越小,它的去除背景效果越好。大家可以試著選擇一個較大的值比如80,再來看看此時醬色曲線的軌跡。當然也不能取太小的值。因為如果取值太小,大家可以想象這個十分微小的球就會滾入光密度曲線內部,造成有效陽性信號的損失。個人感覺5~20是一個比較好的取值范圍。


我們可以對每條泳道依葫蘆畫瓢進行以上類似的背景排除工作。不過有時候如果大家覺得可以使用同樣的標準,即相同的“Rolling Disk Size"進行排除,那么我們可以在“Lane Backgroud Substruction"對話框中選擇上方的“All Lanes On(same level)"選項。然后在“Rolling Disk Size"中填上一個合適的值,點擊“Done"按鈕確認就可以了。此時該電泳圖片上所有的泳道都以相同的標準進行了背景去除。


3.創建條帶:


前面我們已經識別和分析了電泳圖片的泳道,下面我們開始研究電泳條帶的問題。首先在這里明確兩個名詞翻譯:“Lane"指電泳泳道;“Band"指電泳條帶(在下文中一律使用這兩個英文名詞來表示這兩個意思)。


a.電泳條帶的識別:和前面研究Lane一樣,首先我們要對Lane上的Band進行識別。識別方式同樣分為自動識別和人工識別。自動識別的時候選擇“Band-Detect Bands..."命令。這時Quantity One會自動彈出一個“Detect Bands"的對話框。


注意:


第一次用Quantity One時,您的Bands識別以后僅僅是畫出了一條紅色的粗線,而在上面的演示圖片中卻是上下括號的形式。其實大家可以在“Band-Band Attributes"選項中設置Bands的顯示形式。在下方的“Style"選項卡中選擇“Brackets"就會將原來的粗線改為括號形式了。


b.如果要自動識別所有Lanes上的Bands就鉤選Lands后面的“All"選項;如果僅僅想自動識別某一條Lane上的Bands就鉤選“One",然后在后面的輸入框中填上您想識別的泳道號碼;


如果僅僅想識別泳道上部分光密度值最強的Bands,可以在“Bands"后面的選項中選擇“Limit",然后填上相應的數目(比如10)。Quantity One就會僅識別該泳道上光密度最大的10條Bands;


如果您發現自動識別的Bands寬度太窄,圈定Band的紅色括號內范圍小于黑色的光密度影。此時可以使用“Lane Width"命令來調整Bands識別的寬度。用鼠標點擊“Lane Width"后面的向上箭頭就會發現紅色括號逐漸變寬,最后要求其范圍略為寬過其包繞的Band影跡;


如果您發現自動識別功能沒有識別您想要的Band或者誤識別了您不想要的Band,您還可以使用上面的工具欄進行“添加"或“刪除"。將您的鼠標指向每個圖標,Quantity One就會知道彈出一個黃色的提示信息告訴您這個按鈕的功能。



4.高斯建模與結果分析:


a.高斯建模,即用數學方法(微積分)對正態分布曲線進行統計分析。理論上每道band的光密度都呈正態分布的平滑曲線(每個band中間位置蛋白壓縮最緊濃度最高,向上向下因擴散而減弱);然而實際操作過程中,如果熒光過強,往往出現類似方波的曲線(曲線無peak峰,上方為平滑直線,超識別的最高閾值);熒光較弱宜出現波浪樣(多)波峰,或難與背景區分。


首先電腦會統計band中每個點的光密度值,并對這些值按正態分布進行歸類,當讀值不符合正態分布的原理時,電腦會自動做出選擇以對偏離正態分布的數據進行統計學取舍(置信區間),從而最終優化光密度曲線呈正態分布。


如何進行高斯建模呢?很簡單,只要執行“Band-Gauss Model Bands..."命令就可以了,執行后Quantity One回彈出一個對話框問您要對那條泳道進行高斯建模。請鉤選“One",然后再輸入需要建模的泳道代碼就可以了;如果選擇了“All"則對所有泳道進行高斯建模,當然建模這么多泳道會費一點時間了。


b.觀察結果:執行完高斯建模以后使用“Band-Band Information"命令來觀察結果。方法是將變成藍色驚嘆號的鼠標移到剛才已經識別的Band的部位,一個詳細的“Band Information"信息框就會立刻彈出來。在這幅圖中我們必須注意的是“Trace"和/或“Gauss Model Trace",因為我們剛才辛苦了半天就是為了得到這個數據。這個數據表示的就是Band光密度分布曲線下面積,也就是Quantity One用來表達Band內分子總量的方式。


最后,我們計算、記錄的值,應該是“Gauss Model Trace"這一欄的讀值。

                                                                                                                                          本篇轉至實驗之家


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